采用石英晶体微天平追踪生物膜

引言

生物膜是微生物附着到表面。微生物在表面形成薄膜,生物膜因此得名。本应用报告专门处理细菌生物膜,它会在电极上将化学物质转化为电流。基于这一功能,我们称其为电化学活性生物膜(EABs)。对EABs感兴趣的领域从微生物燃料电池中作为生物负极和生物正极,到新型生物传感器,以及可持续化学的生物合成。
本应用报告展示的结果是硫还原地杆菌的,这是一种不耐氧的细菌,能够在电极上生长。[1]
如果你还不熟悉石英晶体微天平,请查看应用报告《石英晶体微天平原理》。

实验说明

硫还原地杆菌的培养在本文中不讨论。硫还原地杆菌是一种非致病性BSL-1生物制剂。
与通常的电化学实验不同,电流必须收集多天以给生物膜生长留出时间。选择一个合适的采样速率,如每五分钟测量一次。我们只展示了一天的生长。
Gamry带夹套的EuroCellTM电化学电解池作为反应容器。采用10 MHz金涂布晶片。饱和Ag/AgCl电极作为参比电极。
反应容器的所有部分在生物膜生长之前进行杀菌处理。[2]由此,组装好的反应容器是无菌的。然后加入生物生长培养基。氧气采用20% CO2和80% N2的混合气进行排除。电极电压采用Gamry FrameworkTM软件中的计时电流脚本固定在0 VAg/AgCl。加入硫还原地杆菌的悬浮细胞培养液,记录电流。

结果

生物膜生长原理

Photograph of biofilm grown on the 10 MHz Au-coated crystal for the eSorptionPro图1 10 MHz金涂布晶片上生物膜生长的照片。

生物膜能够长在金涂布晶片上(图1)。金表面上的粉色区域就是生物膜。生物仅在金上能够找到,这是因为电极是从生物膜代谢乙酸(有机碳的来源)过程中生成电子的电子阱。为了存活和生长,生物膜必须具有电子阱。因此,像塑料涂层处的表面不接收电子,没有生物膜生长。当研究EABs时,电化学系统要设计为电极是唯一电子阱。电极处发生的电化学半反应为:

The electrochemical half-reaction occurring at the electrode

生物膜在乙酸向二氧化碳的电化学转化过程中扮演催化剂的角色。上述半反应是对生物膜中单个细胞所发生反应的整体描述。它不包括碳同化为生物量。电子达到电极表面的准确路径很复杂,此处不讨论。
对于硫还原地杆菌生物膜,乙酸半反应在比-0.4 VAg/AgCl更正的电极电压处激活。该值对大多数的金和碳表面都是正确的。图2显示了硫还原地杆菌和乙酸出现时固定电极电压为0 VAg/AgCl的测试结果。吸附到电极的细胞形成初始生物膜。为了存活,初始生物膜代谢乙酸,产生电子。这将产生电子流,是图2中电流增加的原因。

Current output over time of a growing G. sulfurreducens biofilm. The electrode p图2 生长硫还原地杆菌生物膜的电流输出随时间的变化曲线。电极电压固定为0 VAg/AgCl

当生物膜在生长时,电流增加。看起来,EABs的电流输出随时间变化曲线是一条增长曲线。通过将图2数据绘制成半对数曲线(图3),很容易查看到指数式生长。开始区域是指前生长期或迟滞期。

Semilogarithmic plot of current output over time. The linear region reflects exp图3 输出电流随时间变化的半对数曲线。线性区域反映指数生物生长规律。

标准惯例是采用扫描电镜确认生物膜的存在。图4显示了生物膜固定(标准流程)后的显微图。平的背景是裸金表面。生物膜被故意移除以在同一张图上看到金表面和生物膜。显微图是生物膜产生电流的直观指示。如果生物膜都像图1中的红色块那么明显,一张照片就足够了。

After fixation, the biofilm is no longer alive. Single cells and multi-layered c图4 生物膜在金涂布晶片上生长并标准固定后的扫描电镜显微图。固定后,生物膜不再有活性。
可以看到单个细胞和多层细胞团。

生物膜伏安曲线

在生物膜生长过程中,计时电流脚本可以在不伤害生物膜的情况下停止。这一点对简单的伏安扫描很重要。循环伏安因为很简单,通常是优选脚本。图5显示了生长生物膜(重复)在44小时和49小时的两个循环伏安曲线。在-0.33 VAg/AgCl到-0.23 VAg/AgCl之间能观察到多个氧化还原峰重叠的催化波。当扫描达到正电压,氧化还原峰的影响最小化。在这一电压区间,观察到有限电流。催化波的高度随生物膜的生长增加。

Cyclic voltammograms of a G. sulfurreducens biofilm during growth. 图5 硫还原地杆菌生物膜生长过程中的循环伏安曲线。扫速为30 mV/s。
(注意为了跑循环伏安脚本,计时电流扫描停了。)

QCM频移

细胞吸附和生物膜生长可以采用Gamry电化学石英晶体微天平(eQCM)实时监测。应用Gamry ResonatorTM软件,串联频移(dFseries)和电流可以同时记录。图6显示了生物膜生长过程中的dFseries和简化Q(第二y轴)。这张图与图2中的电流同时采集。为清楚起见,图分开画。

Response to biofilm growth on the QCM图6 QCM测量dFseries和简化Q随时间减小的曲线,对应生物膜生长的响应。这些数据与图2中的电流数据同时采集。

图2中生物膜得到40 μA电流输出的时间内,dFseries达到-1250 Hz。通常,对于刚性膜,dFseries可以采用Sauerbrey方程转变为质量。然而,简化Q从1500到1000的减小表明生物膜刚性的显著降低。作为参考,铜电镀在QCM上伴随约1800 Hz的dFseries变化,引起简化Q从1280到1240的小减小。重要的点是通常采用Sauerbrey方程将生物膜的dFseries转变为质量是不正确的,因为生物膜是粘性的。
对于大多数的刚性膜沉积,采用QCM测量dFseries随电荷变化的曲线是直线(如铜电镀)。但在硫还原地杆菌生物膜案例中,这是不正确的。2原因是流经的电荷不能决定电极上生物膜长了多少。例如,很可能流经电极的总电荷随着时间增加了,但没有生物膜生长。随时间变化的电流与硫还原地杆菌生物膜更相关,因为电流代表生物膜生长。图7确认了这一预期,显示了dFseries和电流的线性相关性。

dFseries vs current图7 dFseries随电流变化(红线为线性拟合)。

总结

本应用报告向领域之外的研究工作者介绍了电化学活性生物膜,并展示了eQCM如何能够整合进基础电化学技术中。这对那些想要了解可以用来研究电化学活性生物膜的技术的高校、本科生或新研究生也很有用。QCM除了能够监测生物膜生长外,还有很多用处:

  • 化学和生物传感器
  • 电聚合反应
  • Li+嵌入
  • 腐蚀研究
  • 电沉积

Gamry公司由衷感谢美国华盛顿州立大学生物膜研究课题组的Jerome T. Babauta博士和Haluk Beyenal教授给我们提供的实验数据。

参考文献


[1] Bond, D.R. and Lovley, D.R., Electricity production by Geobacter sulfurreducens attached to electrodes, Appl. Environ. Microb. 2003, 69(3), 1548−1555.

[2] Babauta, J.T.; Beasley, C.A., and Beyenal, H., Investigation of Electron Transfer by Geobacter sulfurreducens Biofilms by using an Electrochemical Quartz Crystal Microbalance, ChemElectroChem 2014, 1(11), 2007−2016.